BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI BÍCH MAI TÌNH TRẠNG BIẾN ĐỔI GEN KRAS, BRAF VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN MMR Ở NGƯỜI BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Y sinh học di truyền Mã số : 9720101 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2026
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI: TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Cẩm Phương TS. Đoàn Thị Kim Phượng Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường, tại Trường Đại học Y Hà Nội. Vào hồi…….giờ, ngày…….tháng…….năm 2026 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Đại học Y Hà Nội
1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN ĐẶT VẤN ĐỀ 1. Tính thời sự của đề tài Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là loại ung thư được chẩn đoán phổ biến thứ ba và là nguyên nhân thứ hai gây tử vong do ung thư trên toàn thế giới. Theo GLOBOCAN 2022, UTĐTT là một trong năm loại ung thư hay gặp nhất Việt Nam ở cả 2 giới. Hai cơ chế phân tử khác nhau liên quan đến sinh bệnh học UTĐTT là sự mất ổn định nhiễm sắc thể (CIN - Chromosomal Instability) chiếm khoảng 75% và sự mất ổn định vi vệ tinh (MSI - Microsatellite Instability) chiếm khoảng 15% đóng vai trò chính. CIN ảnh hưởng đến các gen như APC, KRAS, BRAF, PI3K và TP53. MSI được gây ra bởi sự bất hoạt của các gen liên quan đến việc sửa chữa bắt cặp sai DNA. Mất biểu hiện của các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) bao gồm MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2 có thể do các biến đổi tự phát hoặc đột biến dòng mầm như hội chứng Lynch. Đột biến KRAS và BRAF có liên quan đến con đường dẫn tín hiệu RAS/RAF/MAPK có vai trò quan trọng trong sự phát triển UTĐTT. Cả đột biến BRAF và trạng thái MMR đều phân biệt các khối u mắc phải với các khối u liên quan đến hội chứng Lynch. Hơn nữa, sự hiện diện của đột biến BRAF ở người bệnh UTĐTT thiếu bộc lộ MLH1 gợi ý là khối u mắc phải chứ không phải là khối u hội chứng Lynch. Việc đánh giá các dấu ấn sinh học phân tử trên thực hành lâm sàng hiện nay đã dần trở thành thường quy, tuy nhiên chủ yếu chỉ phục vụ mục đích xét điều trị đích (như đánh giá tình trạng đột biến gen KRAS, BRAF) hay xét điều trị miễn dịch (như đánh giá tình trạng dMMR, MSI) mà thường bỏ sót các trường hợp dMMR có nguy cơ mắc Hội chứng Lynch - hội chứng UTĐTT di truyền hay gặp nhất mà có thể phát hiện, chẩn đoán sớm, không chỉ có ý nghĩa điều trị cho người bệnh mà còn giúp tầm soát cho người thân. Thêm vào đó, các dữ liệu mô tả đặc điểm về các đột biến KRAS và BRAF cũng như tình trạng MMR và biến thể gen MMR - hội chứng Lynch ở người bệnh UTĐTT người Việt Nam còn nhiều hạn chế. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Tình trạng biến đổi gen KRAS, BRAF và biểu hiện protein MMR ở người bệnh ung thư đại trực tràng” với 02 mục tiêu sau: 1: Xác định đặc điểm các biến thể của gen KRAS, BRAF và tình trạng biểu hiện protein MMR ở người bệnh UTĐTT. 2: Phân tích mối liên quan giữa một số đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học với các biến thể gen và biểu hiện protein MMR ở nhóm người bệnh trên. 2. Những đóng góp mới của luận án - Tỷ lệ đột biến gen KRAS là 48,2%, chủ yếu tại codon 12/13; tỷ lệ đột biến gen BRAF là 6,0%, chủ yếu tại codon 600; tỷ lệ đồng đột biến gen KRAS và BRAF là 1,4%; Tỷ lệ mất biểu hiện protein MMR là 14,7%, thường gặp nhất là mất MLH1 và PMS2.
2 - Phát hiện 8 biến thể gây bệnh trên các gen MMR, gồm: 4 biến thể gen MLH1, 2 biến thể gen PMS2, 1 biến thể gen MSH2, và 1 biến thể gen EPCAM. - Có mối liên quan giữa giới tính và đột biến gen KRAS ở người bệnh UTĐTT; nữ giới có nguy cơ đột biến cao hơn nam giới. - Không ghi nhận mối liên quan giữa các yếu tố nghiên cứu với đột biến gen BRAF. - Người bệnh <60 tuổi, có tiền sử gia đình, có người thân mắc ung thư, thể ung thư biểu mô tuyến có thành phần nhày và khối u ở đại tràng lên, góc gan và đại tràng sigma có nguy cơ mất biểu hiện protein MMR. - Các trường hợp mang biến thể gen MMR (hội chứng Lynch) đều có tiền sử gia đình mắc ung thư, được chẩn đoán ở tuổi trẻ, có dMMR và không đột biến gen BRAF. 3. Bố cục của luận án Luận án gồm 115 trang, trong đó phần đặt vấn đề 02 trang, tổng quan tài liệu 33 trang, đối tượng và phương pháp nghiên cứu 18 trang, kết quả nghiên cứu 24 trang, bàn luận 34 trang, kết luận 02 trang và kiến nghị 01 trang. Luận án có 26 bảng, 22 hình, và 03 biểu đồ; 172 tài liệu tham khảo. Nghiên cứu sinh có 03 bái báo đã đăng trên các tạp chí chuyên ngành có uy tín, trong đó có 01 bài báo Tiếng Anh. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Dịch tễ học và cơ chế bệnh sinh trong UTĐTT UTĐTT là một trong năm ung thư phổ biến nhất trên thế giới và tại Việt Nam, thường gặp ở người trên 50 tuổi nhưng tỷ lệ mắc đang gia tăng ở nhóm trẻ dưới 50 tuổi. Bệnh có liên quan đến nhiều yếu tố nguy cơ như chế độ ăn nhiều chất béo, ít chất xơ, béo phì, lối sống ít vận động, hút thuốc, lạm dụng rượu, tiền sử gia đình và các hội chứng di truyền như Lynch hay đa polyp tuyến gia đình. Hiện nay, chẩn đoán UTĐTT dựa trên sự kết hợp giữa lâm sàng, cận lâm sàng, mô bệnh học, xét nghiệm hình ảnh và sinh học phân tử nhằm phân tầng nguy cơ và cá thể hóa điều trị. Điều trị thường áp dụng theo phương pháp đa mô thức, trong đó vai trò của sinh học phân tử ngày càng quan trọng để lựa chọn liệu pháp phù hợp. Về nguồn gốc, khoảng 65% UTĐTT là dạng mắc phải do đột biến sinh dưỡng hoặc biến đổi biểu sinh, 25% có tính chất gia đình, 5% liên quan hội chứng di truyền, còn lại do biến thể gen độ thấm thấp hoặc chưa rõ. Quá trình phát triển UTĐTT diễn ra qua ba giai đoạn khởi đầu, thúc đẩy và tiến triển, với ba con đường phân tử chính đã được xác định: mất ổn định nhiễm sắc thể (CIN) chiếm khoảng 75% trường hợp liên quan đột biến các gen như KRAS, BRAF; mất ổn định vi vệ tinh (MSI) chiếm khoảng 15% do rối loạn hệ thống sửa chữa bắt cặp sai DNA (MMR); và kiểu hình methyl hóa đảo CpG (CIMP). Mỗi con đường có cơ chế sinh ung thư và
3 đặc điểm bệnh học riêng, đồng thời đã được ứng dụng trong chẩn đoán, sàng lọc, tiên lượng và điều trị UTĐTT. 1.2. Gen KRAS, BRAF, hệ thống sửa chữa bắt cặp sai DNA (MMR) và mối liên quan trong UTĐTT 1.2.1. Đột biến gen RAS, RAF và mối liên quan trong UTĐTT Gen KRAS (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) gồm 6 exon với tổng chiều dài 45.691 bp, nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 12, mã hóa cho protein K-Ras - một phân tử truyền tín hiệu nội bào xuôi dòng từ thụ thể EGFR thông qua các dòng thác tín hiệu, điển hình là con đường RAS-MAPK. Trong điều kiện sinh lý, hoạt động của Ras được kiểm soát bởi sự cân bằng giữa GEFs và GAPs, giúp duy trì nồng độ Ras-GTP ở mức ổn định. Khi gen KRAS đột biến, protein Ras mất khả năng thủy phân GTP dù vẫn gắn được với GAP, dẫn đến tình trạng hoạt hóa kéo dài và kích hoạt liên tục các con đường tín hiệu xuôi dòng, không còn phụ thuộc vào sự hoạt hóa của EGFR. Điều này giải thích vì sao các liệu pháp trúng đích EGFR thường thất bại ở bệnh nhân mang đột biến KRAS. Đến nay đã ghi nhận hơn 3.000 đột biến điểm trên gen KRAS, trong đó phổ biến nhất là tại codon 12 (82%) và codon 13 (17%) ở exon 2. Những đột biến này được chứng minh có vai trò quan trọng trong tiến triển ung thư cũng như trong cơ chế kháng thuốc ức chế EGFR. Gen RAS (đặc biệt là KRAS và NRAS) có vai trò quyết định trong lựa chọn điều trị UTĐTT. Khoảng 30-50% bệnh nhân UTĐTT mang đột biến KRAS, những trường hợp này hầu như không đáp ứng với liệu pháp kháng EGFR như cetuximab hay panitumumab. Ngược lại, người bệnh có kiểu gen KRAS/NRAS không đột biến có khả năng hưởng lợi lâm sàng cao hơn, với nhiều thử nghiệm chứng minh cải thiện sống còn và sống không tiến triển. FDA đã phê duyệt cetuximab điều trị UTĐTT di căn không mang đột biến KRAS từ năm 2012. Tuy nhiên, không phải tất cả bệnh nhân KRAS/NRAS không đột biến đều chắc chắn đáp ứng, do đó việc xét nghiệm gen RAS trước điều trị là bước bắt buộc nhằm cá thể hóa liệu pháp. Gen BRAF (B-Raf Proto-Oncogene, Serine/Threonine Kinase) nằm trên nhánh dài NST số 7, gồm 18 exon với vùng mã hóa dài 2478 bp, tổng hợp protein B-Raf có 766 acid amin, trọng lượng phân tử khoảng 84 kDa. Protein này thuộc nhóm serine-threonine kinase trong con đường tín hiệu RAS/RAF/MAPK, giữ vai trò điều hòa tăng sinh tế bào. Đã có hơn 30 dạng đột biến được mô tả, trong đó hơn 90% xảy ra tại codon 600 (V600E), thay thế acid amin Glycin thành Valin, làm tăng hoạt tính kinase xuôi dòng và thúc đẩy phân bào ngay cả khi không có tín hiệu kích hoạt. Cơ chế này khiến tế bào ung thư kháng với thuốc ức chế EGFR, do vậy xét nghiệm đột biến BRAF có ý nghĩa quan trọng trước khi chỉ định kháng thể đơn dòng trong UTĐTT. Khoảng 13% bệnh nhân UTĐTT mang đột biến BRAF, đặc biệt V600E có liên quan đến ung thư biểu mô biệt hóa tốt, nhưng không liên quan đến tuổi, giới, vị trí u hay giai đoạn TNM. Lâm sàng cho thấy UTĐTT mang BRAF V600E có tiên lượng xấu, mOS khoảng 12 tháng, tái phát sớm hơn và thường kháng điều trị chuẩn. Đặc biệt, UTĐTT đột biến BRAF V600E thường kèm MSI; trong đó MSI-H/BRAF không đột biến có tiên lượng tốt nhất, còn MSS/BRAF V600E có tiên lượng xấu nhất, các nhóm còn lại có tiên lượng trung gian.
4 1.2.2. Tình trạng biểu hiện protein MMR và gen MMR trong UTĐTT Thiếu hụt sửa chữa DNA là cơ chế bệnh sinh quan trọng trong ung thư, liên quan đến nhiều con đường như sửa chữa tái tổ hợp tương đồng (HRR), sửa chữa bắt cặp sai (MMR), sửa chữa cắt bỏ nucleotide (NER) và sửa chữa cắt bỏ bazơ (BER), trong đó bất thường MMR được quan tâm nhiều nhất trên lâm sàng. Các vi vệ tinh - những chuỗi lặp DNA dễ tích lũy đột biến - thường được kiểm soát bởi hệ thống MMR, với các protein chính là MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2. Khi thiếu hụt một trong các protein này sẽ dẫn đến tình trạng dMMR, gây mất ổn định vi vệ tinh (MSI), trái ngược với MSS (ổn định vi vệ tinh). MSI gặp trong khoảng 15% UTĐTT, trong đó đa số là do bất hoạt biểu sinh MLH1, kèm theo tần suất cao đột biến BRAF V600E và tần suất thấp đột biến APC, KRAS; khoảng 10% liên quan đến đột biến dòng mầm gen MMR gây hội chứng Lynch. Đặc điểm mô học thường thấy ở u dMMR/MSI-H là thâm nhập lympho, mô học nhày hoặc các thể hiếm như carcinôm tủy. Xét nghiệm MMR/MSI hiện được chỉ định để sàng lọc Lynch, tiên lượng và định hướng điều trị: (i) phát hiện Lynch ở UTĐTT và ung thư nội mạc tử cung; (ii) xác định người bệnh UTĐTT giai đoạn II/III không đáp ứng với 5-FU; (iii) chọn lựa bệnh nhân điều trị bằng thuốc ức chế điểm kiểm soát miễn dịch. Các nghiên cứu cho thấy MSI/dMMR thường có tiên lượng tốt hơn so với MSS/pMMR, trừ khi khối u kèm đột biến KRAS hoặc BRAF. Đặc biệt, liệu pháp miễn dịch đã làm thay đổi thực hành lâm sàng, với pembrolizumab và các thuốc ức chế điểm kiểm soát miễn dịch khác chứng minh hiệu quả vượt trội, kéo dài PFS, tăng đáp ứng và giảm độc tính so với hóa trị ở bệnh nhân UTĐTT MSI-H/dMMR tiến triển hoặc di căn. Gen MMR (Mismatch Repair) là nhóm gen chịu trách nhiệm sửa chữa các lỗi bắt cặp sai trong quá trình nhân đôi DNA, đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì tính ổn định của bộ gen. Các gen chính trong hệ thống này gồm MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2. Khi các gen MMR bị đột biến hoặc mất chức năng, cơ chế sửa chữa DNA sẽ suy giảm, làm tích lũy các đột biến thứ phát và dẫn đến hình thành ung thư. Hội chứng Lynch (còn gọi là ung thư đại trực tràng không polyp di truyền - HNPCC) là một rối loạn di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, có nguyên nhân từ đột biến mầm ở các gen MMR. Người mang hội chứng này không chỉ có nguy cơ cao mắc ung thư đại trực tràng mà còn dễ mắc nhiều loại ung thư khác như nội mạc tử cung, buồng trứng, dạ dày, niệu quản và ung thư não. Việc phát hiện bất thường MMR thông qua xét nghiệm miễn dịch hóa mô, PCR hoặc giải trình tự gen có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán, điều trị và dự phòng. Hơn nữa, đánh giá tình trạng MMR còn giúp cung cấp giá trị tiên lượng và định hướng chiến lược điều trị, đặc biệt là gợi ý khả năng đáp ứng với liệu pháp miễn dịch cho một số trường hợp.
5 1.3. Một vài kỹ thuật phát hiện đột biến trên gen KRAS, BRAF, protein MMR và gen MMR trên thực hành lâm sàng 1.3.1. Một vài kỹ thuật phát hiện đột biến gen KRAS, BRAF trên thực hành lâm sàng 1.3.1.1. Phương pháp lai đầu dò đặc hiệu Trong phương pháp này, giai đoạn PCR sử dụng mồi (primer) đặc hiệu giúp khuếch đại chính xác các với các trình tự gen quan tâm. Phân tử biotin được gắn trên mồi nhờ đó cũng được đưa vào sản phẩm khuếch đại. Ở giai đoạn lai, những đoạn DNA được khuếch đại kết hợp chính xác với đầu dò (probe) tương ứng trên test strip, phân tử biotin gắn trên các đoạn này được hoạt hoá bởi streptavidin thành dạng phát màu. Nhờ đó, kết quả dễ dàng được phát hiện bằng cách so màu trên test strip, đối chiếu với thang chuẩn được cung cấp kèm trong kit. Kỹ thuật này có độ nhạỵ rất cao, các phân tử đột biến có nồng độ < 1% vẫn có thể phát hiện được, ưu điểm này có lợi trong các trường hợp mô u ít lấy từ các bệnh phẩm sinh thiết. 1.3.1.2. Kỹ thuật Real-time PCR Real-time PCR là kỹ thuật khuếch đại DNA mà kết quả khuếch đại hiển thị ngay sau mỗi chu kì nhiệt của phản ứng. Ở phương pháp này, kết quả được phân tích ngay trong lúc chạy phản ứng nên không bị nhiễm từ ngoài vào, kết quả thu được nhanh và kiểm soát tốt hơn. Với thời gian nhanh chóng và độ chính xác tương đối cao, Real-time PCR được sử dụng để xác định nhanh đột biến KRAS và BRAF. Trong nghiên cứu của chúng tôi sử dụng phương pháp Real-time PCR để phân tích tình trạng đột biến gen KRAS và BRAF. 1.3.1.3. Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới Giải trình tự gen thế hệ mới ra đời là một bước đột phá trong giải mã bộ gen người. Công nghệ giải trình tự đã đạt được khả năng giải trình tự toàn bộ bộ gen của con người với thông lượng, khả năng mở rộng và tốc độ cực cao ở mức độ mà công nghệ giải trình tự Sanger không thể thực hiện được. Hầu hết các nền tảng giải trình tự đều có ba bước chung: Bước 1: Tạo thư viện ADN bằng cách phân mảnh DNA ngẫu nhiên, sau đó nối các adapter ngắn vào hai đầu mỗi sợi ADN. Bước 2: PCR khuyếch đại gen. Bước 3: Giải trình tự các đoạn ADN đã gắn trên mỗi bead từ theo nguyên lý pyrosequening. 1.3.2. Các phương pháp xét nghiệm đánh giá tình trạng bất ổn định vi vệ tinh hiện nay 1.3.2.1. Hóa mô miễn dịch Hóa mô miễn dịch (HMMD) là kỹ thuật sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát hiện kháng nguyên trong mô, giúp đánh giá tình trạng biểu hiện protein MMR (MLH1, PMS2, MSH2, MSH6). Dựa trên tín hiệu nhân, HMMD phân biệt mẫu còn biểu hiện (dương tính) hay mất biểu hiện (âm tính). Sự mất phối hợp
6 PMS2 với MLH1 hoặc MSH6 với MSH2 phản ánh cơ chế liên kết dimer, gợi ý các đột biến dòng mầm tương ứng hoặc bất hoạt gen do methyl hóa. Trường hợp mất MLH1 cần xét nghiệm BRAF V600E và tình trạng methyl hóa để phân biệt ung thư đại trực tràng mắc phải với hội chứng Lynch. HMMD không chỉ xác định tình trạng pMMR/dMMR mà còn định hướng nguyên nhân bệnh sinh và chỉ định xét nghiệm di truyền, đặc biệt khi nghi ngờ hội chứng Lynch. 1.3.2.2. Kĩ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) * Giải trình tự trong phát hiện tình trạng bất ổn định vi vệ tinh Việc phát hiện MSI từ các mẫu khối u bằng hóa mô miễn dịch là kỹ thuật phổ biến và tương đối dễ thực hành trên lâm sàng từ giá thành cho đến kỹ thuật thực hiện. Tuy nhiên, nhược điểm chính của MSI-HMMD là không có khả năng phát hiện MSI do đột biến điểm hoặc đột biến chèn/mất đoạn nhỏ trong protein MMR và vẫn cho kết quả HMMD dương tính (pMMR). Để khắc phục những hạn chế của các phương pháp MSI-HMMD và MSI-PCR, các xét nghiệm giải trình tự thế hệ mới (NGS) kết hợp với các thuật toán phân tích thống kế tin sinh đã được phát triển để phát hiện tình trạng MSI. Một số bảng gen giải trình tự phát hiện MSI như MSIPlus hay ColoSeq. Do MSI-H được coi là một dấu ấn sinh học dự đoán đáp ứng với sự các thuốc ức chế điểm kiểm soát miễn dịch, do đó xét nghiệm MSI sẽ được đưa vào là xét nghiệm thường quy trên thực hành lâm sàng. * Giải trình tự trong phát hiện các biến thể gen tổng hợp protein MMR Chẩn đoán xác định Hội chứng Lynch được tiến hành dựa trên xét nghiệm di truyền phân tử phân tích các biến thể gây bệnh dạng dị hợp tử trên các gen MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 và EPCAM. Ngoài ra, các biến thể dòng mầm trên gen EPCAM (không thuộc hệ thống gen MMR) có thể phá vỡ con đường MMR bằng cách làm bất hoạt gen MSH2 liền kề (mặc dù gen MSH2 không bị đột biến), từ đó cũng gây nên bệnh cảnh của Hội chứng Lynch. 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về đặc điểm các biến thể gen KRAS, BRAF, biểu hiện protein MMR và các gen MMR Các đột biến gen KRAS, BRAF cùng với tình trạng mất chức năng của hệ thống sửa chữa bắt cặp sai (MMR) có vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh, tiên lượng và định hướng điều trị ở người bệnh UTĐTT. Nhiều nghiên cứu quốc tế và trong nước đã tập trung vào đặc điểm dịch tễ, ý nghĩa lâm sàng và phân bố của các biến thể gen này, cũng như chẩn đoán hội chứng Lynch. Trên thế giới, đột biến KRAS được phát hiện ở 35-50% trường hợp UTĐTT, chủ yếu tại codon 12/13, trong đó biến thể G12C chiếm khoảng 3% và hiện đã có thuốc nhắm đích chuyên biệt. Tỷ lệ đột biến RAS (KRAS/NRAS) ở UTĐTT di căn dao động 40-45%, song có sự khác biệt về địa lý với tần suất thấp hơn tại châu Á. Đột biến BRAF V600E chiếm 8-12% ở người da trắng nhưng thấp hơn ở châu Á và Mỹ Latin (3-8%), có liên quan chặt chẽ đến tiên lượng xấu và đã có phác đồ điều trị mới với encorafenib kết hợp cetuximab cải thiện thời
7 gian sống thêm. Tình trạng dMMR/MSI-H gặp ở 10-15% UTĐTT giai đoạn sớm và 4-5% UTĐTT di căn, được phát hiện hiệu quả bằng hóa mô miễn dịch với bốn dấu ấn MMR (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2), phù hợp với xét nghiệm MSI bằng PCR, và là cơ sở cho sàng lọc hội chứng Lynch - nguyên nhân di truyền phổ biến nhất của UTĐTT. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu ghi nhận tỷ lệ đột biến KRAS khoảng 48% (chủ yếu exon 2), đột biến BRAF từ 6-9%, trong khi MSI-H/dMMR có thể cao hơn một số quần thể khác, song kết quả chưa thống nhất do khác biệt về cỡ mẫu và kỹ thuật. Một nghiên cứu tại Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh ghi nhận tỷ lệ hội chứng Lynch ước tính 6,3% với nhiều trường hợp không có tiền sử gia đình rõ ràng, nhấn mạnh giá trị của chiến lược sàng lọc toàn diện. Một nghiên cứu quốc tế khác trên người Việt cho thấy tỷ lệ MSI-H 45,0%, KRAS 37,1% và BRAF 2,6%, đồng thời ghi nhận sự đồng tồn tại đáng kể giữa MSI-H với đột biến KRAS và BRAF. Tuy nhiên, dữ liệu trong nước còn rời rạc, chưa có nhiều nghiên cứu sử dụng kết hợp HMMD, PCR và NGS, cũng như chưa có nghiên cứu nào chẩn đoán hội chứng Lynch từ các trường hợp dMMR. Do đó, việc thực hiện nghiên cứu này là cần thiết nhằm góp phần làm rõ hơn đặc điểm của ba dấu ấn sinh học quan trọng này ở người bệnh UTĐTT tại Việt Nam. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu gồm các người bệnh được chẩn đoán UTĐTT, có chỉ định xét nghiệm đột biến gen KRAS, BRAF và tình trạng biểu hiện protein MMR. - Thời gian thu thập mẫu nghiên cứu: từ tháng 01/2022 đến tháng 06/2023. 2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn - Người bệnh có chẩn đoán xác định là UTĐTT - Có đủ tiêu bản, khối nến của khối u để làm xét nghiệm gen KRAS, BRAF và tình trạng biểu hiện protein MMR. - Được làm xét nghiệm đột biến gen KRAS và BRAF tại Đơn vị Gen - Tế bào gốc, Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu và xét nghiệm hóa mô miễn dịch đánh giá biểu hiện protein MMR tại Trung tâm Giải phẫu bệnh - Tế bào học, Bệnh viện Bạch Mai. - Đối với nhóm người bệnh có tình trạng mất biểu hiện protein MMR (dMMR), cần có sự đồng ý của người bệnh khi tiếp tục làm xét nghiệm di truyền. - Có hồ sơ bệnh án đầy đủ các thông tin cần thu thập. 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ - Các trường hợp thực hiện xét nghiệm đột biến KRAS, BRAF và đánh giá tình trạng MMR không cùng trên một mẫu bệnh phẩm.
8 - Mẫu bệnh phẩm không đủ lượng u để làm đủ các xét nghiệm đột biến KRAS, BRAF và đánh giá tình trạng MMR. - Các trường hợp có thể gây sai lệch trong quá trình phân tích di truyền (đối với các trường hợp dMMR cần tiến hành lấy máu để tìm đột biến dòng mầm): tiền sử ghép tế bào gốc tạo máu hoặc tủy xương, các trường hợp kèm theo chẩn đoán các ung thư huyết học, tiền sử truyền máu trong vòng 4-6 tháng,.. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả, cắt ngang, hồi cứu kết hợp tiến cứu 2.2.2. Thời gian nghiên cứu - Thời gian tiến hành nghiên cứu: từ tháng 01/2023 đến tháng 12/2024. 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu - Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này tại Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai. 2.2.4. Cỡ mẫu - Cỡ mẫu nghiên cứu được chọn theo phương pháp lấy mẫu toàn bộ bao gồm tất cả các người bệnh tiến hành xét nghiệm gen KRAS, BRAF và đánh giá tình trạng biểu hiện protein MMR trong thời gian thu thập mẫu nghiên cứu. Nghiên cứu của chúng tôi lấy mẫu toàn bộ trong thời gian từ 1/2022 đến tháng 6/2023 thu được 218 người bệnh đủ tiêu chuẩn lựa chọn. 2.2.5.Nội dung nghiên cứu Mục tiêu 1: Xác định đặc điểm các biến thể của gen KRAS, BRAF và tình trạng biểu hiện protein MMR ở người bệnh UTĐTT. - Xác định các biến thể gen KRAS, BRAF, đánh giá tình trạng biểu hiện protein MMR, tư vấn di truyền và ghi nhận các biến thể gen MMR (nếu có) - Xét nghiệm và tư vấn trên được tiến hành bằng các quy trình: + Quy trình xét nghiệm đột biến gen KRAS và BRAF theo phương pháp Realtime PCR: thực hiện tại Đơn vị Gen - Tế bào gốc, Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai + Quy trình đánh giá tình trạng biểu hiện protein MMR: thực hiện tại Trung tâm Giải phẫu bệnh - Tế bào học, Bệnh viện Bạch Mai + Quy trình Tư vấn di truyền: thực hiện tại Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai + Quy trình giải trình tự gen MMR bằng giải trình tự thế hệ mới (NGS): thực hiện tại viện Di truyền y học + Quy trình giải trình tự gen Sanger: thực hiện tại viện Di truyền y học - Kết quả xác định tình trạng đột biến gen KRAS, BRAF, tình trạng biểu hiện protein MMR và các biến thể gen MMR được đánh giá cụ thể theo hướng dẫn trong quy trình kỹ thuật.
9 Mục tiêu 2: Phân tích mối liên quan giữa một số đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học với các biến thể gen và biểu hiện protein MMR ởnhóm người bệnh trên. - Phân tích mối liên quan giữa một số đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học với các biến thể gen và tình trạng biểu hiện protein MMR. - Các bước thực hiện: + Tra cứu hồ sơ bệnh án, thu thập số liệu các đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học vào bệnh án nghiên cứu + Ghi nhận các kết quả về đặc điểm các biến thể của gen KRAS, BRAF và tình trạng biểu hiện protein MMR và gen MMR vào bệnh án nghiên cứu + Tiến hành phân tích mối liên quan bằng các thuật toán thống kê 2.2.6. Các quy trình kĩ thuật trong nghiên cứu Quy trình xét nghiệm đột biến gen KRAS và BRAF theo phương pháp Realtime PCR Quy trình xét nghiệm và đánh giá kết quả biểu hiện protein MMR Quy trình tư vấn di truyền Quy trình giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) Quy trình giải trình tự Sanger cho các trường hợp phát hiện các biến thể gây bệnh qua phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) 2.2.7. Các biến số và chỉ số nghiên cứu Mục tiêu 1: Thu thập các số liệu về tình trạng gen KRAS, gen BRAF, tình trạng biểu hiện protein MMR và các biến thể gen MMR Mục tiêu 2: Thu thập các số liệu về tuổi, giới, tiền sử bản thân, tiền sử gia đình, các cấp bậc người thân, thể mô bệnh học, các vị trí u đại trực tràng, vị trí u di căn và tình trạng tắc ruột 2.3. Xử lý số liệu Số liệu nghiên cứu được xử lý bằng SPSS 24.0, trình bày dưới dạng bảng biểu với các chỉ số mô tả như tỉ lệ phần trăm, trung bình, độ lệch chuẩn, giá trị nhỏ nhất và lớn nhất. Biến định lượng có phân bố chuẩn được thể hiện bằng trung bình ± SD, biến không phân bố chuẩn bằng trung vị, còn biến định tính bằng tần số và tỉ lệ phần trăm. Phân tích thống kê sử dụng ANOVA để so sánh biến định lượng, Chi-square cho biến định tính và hệ số OR (CI 95%) để đánh giá mối liên quan giữa đột biến gen KRAS, BRAF, protein MMR và đặc điểm bệnh học UTĐTT, với p<0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. 2.4. Hạn chế sai số của nghiên cứu - Các thông tin trong hồ sơ bệnh án được thu thập đầy đủ và chi tiết - Hạn chế âm tính giả và dương tính giả khi xét nghiệm đột biến gen KRAS và BRAF, hóa mô miễn dịch và giải trình tự thế hệ mới bằng cách tuân thủ đúng quy trình kỹ thuật, đảm bảo có nội kiểm và ngoại kiểm đầy đủ, định kỳ. - Việc xử lý và phân tích số liệu cũng được tiến hành một cách khoa học và
10 chính xác để tránh các sai số trong quá trình tính toán. 2.5. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu - Nghiên cứu đã được thông qua bởi Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học theo quyết định số 837/GCN-HĐĐĐNCYSH-ĐHYHN cấp ngày 16/05/2023. - Tất cả các biến số, chỉ số nghiên cứu sẽ được thu thập một cách trung thực và khoa học. - BN đồng ý vào bản thỏa thuận tham gia nghiên cứu và bản cung cấp thông tin về nghiên cứu. - Mọi thông tin cá nhân của BN sẽ được giữ bí mật và chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu. - Người bệnh và gia đình người bệnh được tư vấn di truyền miễn phí (đối với các trường hợp dMMR cần tiến hành tiếp xét nghiệm di truyền dòng mầm) CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đặc điểm các biến thể gen KRAS, BRAF, gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) và tình trạng biểu hiện protein MMR ở người bệnh UTĐTT Bảng3.1.TỷlệđộtbiếngenKRAS,BRAFvàtìnhtrạngbiểuhiệnproteinMMR Các dấu ấn Tần số (N) Tỷ lệ (%) Gen KRAS Có đột biến KRAS 105 48,2 Không có đột biến gen KRAS 113 51,8 Gen BRAF Có đột biến BRAF 13 6,0 Không có đột biến gen BRAF 205 94,0 Gen KRAS và BRAF Có đồng thời đột biến KRAS và BRAF 3 1,4 Không có đồng thời đột biến gen KRAS và BRAF 215 98,6 Tình trạng biểu hiện protein MMR Bảo toàn biểu hiện protein MMR (pMMR) 186 85,3 Mất biểu hiện protein MMR 32 14,7 n 218 100 Nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận 218 trường hợp UTĐTT đều được tiến hành đánh giá tình trạng gen KRAS, BRAF và biểu hiện protein nhóm MMR.Về tỷ lệ đột biến, có 48,2% người bệnh có đột biến gen KRAS, 6,0% đột biến gen BRAF và có 14,7% người bệnh mất biểu hiện protein MMR. (Bảng 3.1)
11 Bảng 3.2: Vị trí đột biến các gen KRAS, BRAF và đặc điểm tình trạng mất biểu hiện protein MMR Dấu ấn Gen KRAS, BRAF Gen Codon N (%) 12/13 91 (86,6) 60 1 (0,9) KRAS (n=105) 61 2 (1,9) 117 1 (0,9) 146 10 (9,5) 600 12 (92,3) BRAF (n=13) 601 1 (7,7) Tình trạng biểu hiện protein MMR Protein mất biểu hiện N (%) MLH1 3 (9,4) MSH2 1 (3,1) MMR (n=32) MSH6 2 (6,2) PMS2 6 (18,8) MLH1, PMS2 15 (46,9) MSH2, MSH6 5 (15,6) Các đột biến gen KRAS được ghi nhận chủ yếu tại codon 12 và 13 (86,6%), trong khi đột biến gen BRAF tập trung ở codon 600 (92,3%) và có 3 trường hợp mang đồng thời đột biến KRAS và BRAF. Về mất biểu hiện protein MMR, thường gặp nhất là mất đồng thời MLH1 và PMS2 (45,4%), tiếp đến là PMS2 đơn lẻ (21,2%), MSH2 và MSH6 (18,2%), MLH1 đơn lẻ (9,1%) và MSH2 hoặc MSH6 đơn lẻ (3%). (Bảng 3.2) Nghiên cứu thu nhận 218 người bệnh UTĐTT, trong đó 32 trường hợp mất biểu hiện protein MMR. Trong số này, 24 người bệnh được xét nghiệm di truyền và phát hiện 8 trường hợp mang biến thể gây bệnh, 16 trường hợp không phát hiện biến thể gây bệnh, kết quả được trình bày ở hình 3.1. Hình 3.1: Tổng quan nhóm người bệnh mất bộc lộ protein MMR
12 Trong 32 trường hợp dMMR, có 24 người bệnh được tư vấn và thực hiện xét nghiệm di truyền; 8 trường hợp còn lại không xét nghiệm do 1 người bệnh đã tử vong, 1 người bệnh có đột biến BRAF (không có chỉ định chẩn đoán Lynch) và 6 người bệnh không liên lạc được. Tỷ lệ bệnh nhân dMMR được làm xét nghiệm dòng mầm trên các gen MMR là 75% (24/32). Trong đó, 8 trường hợp (33,3%) phát hiện biến thể gây bệnh, 16 trường hợp (66,7%) không phát hiện biến thể. Ngoài ra, 7 người bệnh đã mất hoặc không liên lạc được và 1 trường hợp có đột biến gen BRAF nên không được chỉ định xét nghiệm. Đặc điểm gen trong nhóm 08 người bệnh tìm thấy biến thể liên quan đến Hội chứng Lynch được trình bày trong bảng 3.3 sau: Bảng 3.3. Đặc điểm gen MMR trong nhóm mất bộc lộ protein MMR Tuổi Người Mất biểu hiện chẩn Gen Biến thể Hệ quả Phân lớp bệnh protein MMR đoán NB 1 29 EPCAM c.753T>G:p. Tyr251Ter Vô nghĩa Gây bệnh MSH6 NB 2 58 PMS2 c.1738A>T:p. Lys580Ter Vô nghĩa Gây bệnh PMS2 c.1740-1753del: Dịch NB 3 31 MLH1 Gây bệnh MLH1, PMS2 p. Pro581fs khung c.2231-2235del: p. Dịch NB 4 69 MSH2 Gây bệnh MSH2, MSH6 Thr744AsnfsTer12 khung NB 5 29 MLH1 c.2102A>G:p. Gln701Arg Sai nghĩa Gây bệnh MLH1, PMS2 Dịch NB 6 51 MLH1 c.2089del:p. Leu697fs Gây bệnh MLH1, PMS2 khung NB 7 44 MLH1 c.109G>A:p. Glu37Lys Sai nghĩa Gây bệnh PMS2 Dịch NB 8 68 PMS2 c.746-753del:p. Asp249fs Gây bệnh PMS2 khung Trong nhóm 8 người bệnh có đột biến gen MMR, chúng tôi ghi nhận 4 biến thể trên gen MLH1, 2 trên gen PMS2, 1 trên gen MSH2 và 1 trên gen EPCAM, tất cả đều là biến thể gây bệnh liên quan đến hội chứng Lynch. Gen bị ảnh hưởng nhiều nhất là MLH1, tiếp đến là PMS2, trong khi MSH2 và EPCAM mỗi gen ghi nhận 1 trường hợp. Các đột biến thuộc dạng vô nghĩa, dịch khung và sai nghĩa. Sự mất biểu hiện protein MMR nhìn chung phù hợp với gen bị ảnh hưởng, điển hình như đột biến MLH1 gây mất biểu hiện MLH1 và PMS2, còn đột biến PMS2 gây mất biểu hiện PMS2.
13 3.2. Mối liên quan giữa các biến thể gen và biểu hiện protein MMR với một số đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học ở nhóm người bệnh nghiên cứu 3.3.1. Mối liên quan giữa một số đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học với tình trạng đột biến gen KRAS Bảng 3.4. Một số yếu tố liên quan đến tình trạng đột biến gen KRAS ở người bệnh UT đại trực tràng Gen KRAS Đặc điểm OR (95%CI)* p Có đột biến Không đột biến Giới Nam 54 (40,0) 81 (60,0) 1 0,002 Nữ 51 (61,5) 32 (38,5) 2,39 (1,35 - 4,24) Các đặc điểm khác như tuổi, yếu tố nguy cơ, tiền sử bản thân và gia đình, thể mô bệnh học, vị trí khối u, tình trạng di căn, tình trạng tắc ruột và giai đoạn bệnh chưa ghi nhận có mối liên quan với tình trạng đột biến gen KRAS. Kết quả bảng trên cho thấy có mối liên quan giữa giới tính và tình trạng đột biến gen KRAS ở người bệnh UT đại trực tràng, trong đó đối tượng là nữ giới có nguy cơ đột biến cao gấp 2,39 lần so với nam giới (OR=2,39, 95%CI:1,35 - 4,24). 3.3.2. Mối liên quan giữa một số đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học với tình trạng đột biến gen BRAF Khi phân tích các đặc điểm lâm sàng và mô bệnh học bao gồm tuổi, giới, yếu tố nguy cơ, tiền sử bản thân và gia đình, thể mô bệnh học, vị trí khối u, tình trạng di căn, tình trạng tắc ruột và giai đoạn bệnh nghiên cứu ghi nhận không có mối liên quan giữa các yếu tố với tình trạng đột biến gen BRAF ở nhóm nghiên cứu. 3.3.3. Mối liên quan giữa một số đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học với tình trạng biểu hiện protein MMR ở người bệnh UT đại trực tràng Bảng 3.5. Mối liên quan giữa một số yếu tố lâm sàng và tình trạng biểu hiện protein MMR ở người bệnh UT đại trực tràng Protein MMR Đặc điểm OR (95%CI)* p dMMR pMMR Tuổi ≥ 60 14 (9,3) 136 (90,7) 1 0,001 < 60 18 (26,5) 50 (73,5) 3,50 (1,58 - 7,72) Tiền sử gia đình liên quan đến Hội chứng Lynch Không 17 (10,1) 152 (89,9) 1 0,001
14 Protein MMR Đặc điểm OR (95%CI)* p dMMR pMMR Có 15 (30,6) 34 (69,4) 3,94 (1,75 - 8,90) Cấp bậc người thân mắc ung thư Bậc 1 8 (19,5) 33 (80,5) 1 Bậc 2 8 (80,0) 2 (20,0) 16,5 (2,14 -127,34) 0,0003 Bậc 3 1 (100) 0 (0,0) - - Thể mô bệnh học Ung thư biểu mô tuyến 20 (11,0) 162 (89,0) 1 Ung thư biểu mô tuyến có 9 (29,0) 22 (71,0) 3,31 (1,32 - 8,33) 0,007 thành phần chế nhày Ung thư biểu mô tuyến có 1 (33,3) 2 (66,7) 4,05 (0,35 -47,47) 0,227 thành phần tế bào nhẫn Khác (cụ thể loại mô bệnh 2 (100) 0 (0,0) - - học) Vị trí khối u Trực tràng 3 (4,1) 70 (95,6) 1 Đại tràng lên 5 (22,7) 17 (77,3) 6,86 (1,38 - 33,98) 0,006 Đại tràng ngang 3 (13,0) 20 (87,0) 3,50 (0,64 - 19,27) 0,125 Đại tràng góc gan 3 (25,0) 9 (75,0) 7,78 (1,25 - 48,49) 0,009 Đại tràng góc lách 4 (19,1) 17 (80,9) 5,49 (1,06 - 28,39) 0,022 Đại tràng xuống 3 (23,1) 10 (76,9) 7,00 (1,15 - 42,67) 0,014 Đại tràng sigma 11 (20,4) 43 (79,6) 5,97 (1,49 - 23,81) 0,004 Kết quả cho thấy tuổi, tiền sử gia đình, cấp bậc người thân mắc ung thư, thể mô bệnh học và vị trí khối u đều liên quan đến tình trạng biểu hiện protein MMR ở bệnh nhân UTĐTT. Cụ thể, người bệnh < 60 tuổi có nguy cơ mất biểu hiện protein MMR cao gấp 3,5 lần so với ≥ 60 tuổi; có tiền sử gia đình liên quan đến bệnh cao gấp 3,94 lần; có người thân mắc ung thư bậc 2 cao gấp 16,5 lần so với bậc 1. Bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến có thành phần chế nhày có nguy cơ cao gấp 3,31 lần so với biểu mô tuyến thông thường. Ngoài ra, khối u tại đại tràng lên, góc gan và sigma có nguy cơ mất biểu hiện protein MMR cao gấp lần lượt 6,86; 7,78 và 5,97 lần so với trực tràng.
15 3.3.4. Mối liên quan giữa một số đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học với biến thể các gen MMR ở người bệnh UTĐTT Bảng 3.6. Mối liên quan giữa tiền sửgia đình và các biến thểgen MMR (n=8) Người Tiền sử gia đình Gen bệnh NB 1 Bà nội mất do ung thư di căn phổi năm 71 tuổi (không rõ loại UT) EPCAM 29 tuổi NB 2 Mẹ ruột mất năm 40 tuổi (không rõ bệnh) PMS2 58 tuổi NB 3 Ông nội, bác ruột bên bố mất do đi ngoài phân đen (khoảng năm 40 tuổi) MLH1 31 tuổi NB 4 Em gái ruột UTĐT mất năm 49 tuổi, mẹ đẻ mất năm 51 tuổi (không rõ bệnh) MSH2 69 tuổi NB 5 Cô ruột mắc UT dạ dày năm 46 tuổi MLH1 29 tuổi NB 6 Anh trai ruột mắc UTĐT năm 38 tuổi, mẹ đẻ mất năm 37 tuổi (không rõ bệnh) MLH1 51 tuổi NB 7 Bố ruột mắc UT trực tràng năm 54 tuổi, 2 bác bên bố chẩn đoán UTĐT mất trước 60 tuổi MLH1 44 tuổi NB 8 Mẹ ruột mất năm 60 tuổi (không rõ bệnh) PMS2 68 tuổi Qua khai thác tiền sử gia đình, tất cả các trường hợp mang biến thể gây bệnh gen MMR đều có người thân mắc ung thư liên quan đến hội chứng Lynch. Cụ thể, 5/8 bệnh nhân có người thân bậc 1 và 4/8 có người thân bậc 2 được chẩn đoán ung thư liên quan Lynch hoặc tử vong sớm do bệnh. Bảng 3.7. Đặc điểm nhóm người bệnh có tình trạng dMMR nhưng không tìm thấy biến thể gen MMR (n=16) Đặc điểm n % Nguy cơ cao 7 43,8 (7/16) Đánh giá Nguy cơ vừa 1 6,2 (1/16) nguy cơ theo phả hệ Nguy cơ tương đương dân số 8 50,0 (8/16) chung Trường hợp đáp ứng tiêu chuẩn chẩn đoán Amstesdam II 1 6,3 Trường hợp đáp ứng tiêu chuẩn chẩn đoán Bathesda 10 62,5 Đáp ứng cả hai tiêu chuẩn chẩn đoán trên 1 6,3 Tổng 16 Trong nhóm bệnh nhân dMMR nhưng không phát hiện đột biến dòng mầm gen MMR, 50% có phả hệ nguy cơ cao hoặc vừa, 50% nguy cơ tương đương dân số chung. Có 62,5% (10/16) đáp ứng tiêu chuẩn Bethesda. Đáng chú ý, 1 trường hợp có tiền sử cá nhân và phả hệ nguy cơ cao, đáp ứng đồng thời cả tiêu chuẩn Amsterdam II và Bethesda, tuy nhiên không phát hiện biến thể trên gen MMR.
16 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Đặc điểm các biến thể gen KRAS, BRAF, tình trạng biểu hiện protein MMR và gen MMR 4.1.1. Đặc điểm các gen KRAS, BRAF Nhiều nghiên cứu cho thấy 30-50% bệnh nhân UTĐTT có đột biến gen KRAS, trong đó đột biến tại codon 12 và 13 đóng vai trò quan trọng trong tiến triển ung thư và kháng thuốc kháng EGFR, còn các đột biến tại codon 61 và 146 ít gặp và ý nghĩa lâm sàng chưa rõ ràng. Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ đột biến KRAS là 48,2%, khá phù hợp với báo cáo của Stefanius (45%) và các nghiên cứu khác (Imamura 40%, Tong 44,5%). Sự khác biệt giữa các nghiên cứu có thể do đặc điểm dân số, phương pháp xét nghiệm, tiêu chuẩn chọn mẫu hoặc giai đoạn bệnh, phản ánh tính không đồng nhất giữa các quần thể. Trong 105 trường hợp đột biến KRAS, vị trí thường gặp nhất là codon 12 và 13 (gần 87%). Các nghiên cứu quy mô lớn trên nhiều quần thể cũng ghi nhận tỉ lệ cao tại codon 12 và 13, trong khi codon 61 và 146 ít gặp. Đặc điểm này khẳng định vai trò phổ biến của đột biến KRAS trong cơ chế bệnh sinh UTĐTT. Bên cạnh giá trị chẩn đoán phân tử, KRAS còn là yếu tố tiên lượng và quyết định lựa chọn điều trị, đặc biệt trong kháng liệu pháp kháng EGFR, do đó cần được đánh giá thường quy trong lâm sàng. Trong điều trị nhắm trúng đích EGFR cho UTĐTT, một số người bệnh dù không có đột biến KRAS vẫn không đáp ứng thuốc; nhiều nghiên cứu chứng minh nguyên nhân là do đột biến gen BRAF, tương tự như nhóm có đột biến KRAS. Nghiên cứu của Stec và cộng sự phát hiện 6% bệnh nhân có đột biến BRAF, chủ yếu ở codon 600 với dạng thường gặp nhất là V600E (80-90%). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Foltran (2015) khi tất cả đột biến BRAF ghi nhận đều là V600E. Một số tác giả khác báo cáo tỷ lệ cao hơn, như Nicolantonio (13,9%) hay Ahlquist (22%), trong đó V600E chiếm ưu thế nhưng cũng ghi nhận các dạng hiếm khác như D594G, L597Q, G469R. Đột biến BRAF V600E làm protein BRAF hoạt hóa liên tục qua con đường MAPK/ERK, thúc đẩy tăng sinh tế bào không kiểm soát, dẫn đến tiên lượng xấu và kháng với liệu pháp kháng EGFR đơn thuần. Do vậy, xét nghiệm BRAF V600E có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán, lựa chọn phác đồ điều trị và phân biệt với ung thư di truyền như hội chứng Lynch. Như vậy, tỷ lệ và dạng đột biến gen KRAS, BRAF ở bệnh nhân UTĐTT còn chưa thống nhất giữa các nghiên cứu, có thể do khác biệt trong chọn mẫu, đặc điểm chủng tộc, kỹ thuật xét nghiệm và thời điểm tiến hành. Tuy nhiên, đa số tác giả đều ghi nhận đột biến KRAS chiếm khoảng 30-50%, trong khi đột biến BRAF ít gặp hơn với tần suất dưới 10%.
17 4.1.2. Đặc điểm tình trạng biểu hiện protein MMR Trong nghiên cứu của chúng tôi trên 218 bệnh nhân UTĐTT, 14,7% có mất biểu hiện protein MMR (dMMR) và 85,3% có biểu hiện nguyên vẹn (pMMR). Tỷ lệ dMMR này phù hợp với nhiều nghiên cứu quốc tế và trong khu vực (10-20%), cho thấy tính ổn định giữa các quần thể. Kết quả nhấn mạnh rằng phần lớn bệnh nhân UTĐTT mang pMMR, thường gắn với kiểu hình MSS và phù hợp với hóa trị tiêu chuẩn, trong khi nhóm dMMR không nhạy với fluoropyrimidine đơn thuần nhưng có thể hưởng lợi từ liệu pháp miễn dịch. Điều này khẳng định xét nghiệm MMR không chỉ có giá trị trong tầm soát hội chứng Lynch mà còn trong phân tầng điều trị cá thể hóa cho bệnh nhân UTĐTT. 4.1.3. Đặc điểm gen MMR Trong nghiên cứu của chúng tôi bước đầu khảo sát hội chứng Lynch qua phát hiện các biến thể gen MMR, đã ghi nhận 8 biến thể gen MMR trong số 24 người bệnh được làm xét nghiệm dòng mầm, bao gồm 4 biến thể dịch khung, 2 biến thể vô nghĩa và 2 biến thể sai nghĩa. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, như nghiên cứu của Master D và CS (2018) tại Romania đã xác định được 11 biến thể trên các gen MLH1, MSH6, PMS2 và APC, hay báo cáo của Win AK, Jenkins MA và CS cho thấy tỷ lệ mang biến thể gây bệnh trên các gen MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 lần lượt là 1/1.946; 1/2.841; 1/758 và 1/714, và nguy cơ mắc UTĐTT tăng cao hơn so với các gen khác. Các dạng đột biến vô nghĩa, dịch khung và sai nghĩa trên MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 và EPCAM đều được chứng minh là nguyên nhân quan trọng trong tiến triển UTĐTT ở người bệnh hội chứng Lynch. Cụ thể, đột biến vô nghĩa tạo tín hiệu kết thúc sớm làm protein bị cắt ngắn và mất chức năng, ví dụ như trường hợp đột biến c.354T>A ở exon 2 gen MSH2 được báo cáo trên tạp chí Frontier (2024). Đột biến dịch khung do thêm hoặc mất nucleotide làm thay đổi khung đọc, tạo protein bất thường và gây mất ổn định vi vệ tinh (MSI), đồng thời có thể được phát hiện trong DNA tự do (cfDNA), mở ra hướng ứng dụng trong theo dõi tồn dư bệnh, đáp ứng điều trị và phát hiện tái phát sớm. Trong khi đó, đột biến sai nghĩa thay đổi một acid amin trong protein, có thể ảnh hưởng đến cấu trúc hoặc hoạt tính làm giảm hiệu quả sửa chữa DNA, mặc dù không phải trường hợp nào cũng gây hậu quả nghiêm trọng. Nhìn chung, các dạng đột biến này đều làm suy yếu hoặc mất chức năng protein MMR, gây thiếu hụt sửa chữa DNA, dẫn đến MSI và tăng nguy cơ ung thư trong hội chứng Lynch, trong đó đột biến vô nghĩa và dịch khung thường có tác động mạnh hơn so với sai nghĩa. Việc xác định và phân loại biến thể không chỉ quan trọng trong điều trị, quản lý người bệnh mà còn có ý nghĩa trong tư vấn di truyền, tầm soát và chẩn đoán sớm cho thân nhân của người bệnh.
18 4.2. Mối liên quan giữa các biến thể gen và biểu hiện protein MMR với một số đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học 4.2.1. Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS, BRAF với một số đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học 4.2.1.1. Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS, BRAF với đặc điểm tuổi và giới tính Trong bối cảnh các kỹ thuật sàng lọc ngày càng phát triển, UTĐTT có xu hướng được phát hiện sớm hơn, tuy nhiên lứa tuổi mắc bệnh vẫn tập trung chủ yếu ở nhóm 50 - 70 tuổi, với tuổi trung bình khoảng 60. Trong nghiên cứu của chúng tôi, đột biến gen KRAS và BRAF gặp ở nhóm trên 60 tuổi cao hơn nhóm dưới 60, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p < 0,05), tương tự kết quả của Hoàng Văn Cường (2023) khi ghi nhận tỉ lệ đột biến KRAS ở bệnh nhân ≤ 50 tuổi là 30,1% và > 50 tuổi là 69,9% (p = 0,714). Các nghiên cứu quốc tế cũng cho thấy sự không thống nhất về mối liên hệ giữa tuổi và đột biến gen, chẳng hạn Ye và CS ghi nhận tỷ lệ BRAF V600E tăng theo tuổi, đặc biệt ở nhóm trên 50, trong khi nghiên cứu tại Iran không tìm thấy mối liên hệ đáng kể giữa tuổi và đột biến KRAS, BRAF. Như vậy, mối liên quan giữa tuổi và tình trạng đột biến KRAS, BRAF trong UTĐTT chưa thực sự rõ ràng. Về giới tính, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ đột biến KRAS ở nữ cao hơn nam, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05), gợi ý khả năng tồn tại yếu tố liên quan đến giới trong cơ chế sinh bệnh học của đột biến này, trong khi BRAF không có sự khác biệt giữa hai giới. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu lớn, như nghiên cứu trên 11.117 người bệnh UTĐTT di căn tại Hoa Kỳ cho thấy nữ giới có nguy cơ cao hơn đối với đột biến KRAS (OR = 1,33) và BRAF (OR = 1,84), hay báo cáo của Afrasanie và CS ghi nhận KRAS phổ biến hơn ở nữ (46,0%) so với nam (34,4%). Những dữ liệu này góp phần khẳng định tính nhất quán của kết quả, đồng thời gợi mở ý nghĩa tiềm năng trong việc xác định chiến lược chẩn đoán và điều trị cá thể hóa cho người bệnh UTĐTT dựa trên yếu tố giới tính và đặc điểm đột biến gen. 4.2.1.2. Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS, BRAF với đặc điểm tiền sử bản thân và tiền sử gia đình Về tiền sử bản thân, nghiên cứu tại Kenya cho thấy đột biến KRAS thường gặp hơn ở người bệnh UTĐTT giai đoạn tiến triển và có liên quan đến mức độ xâm lấn hạch, nhưng không chứng minh được mối liên hệ rõ ràng với các bệnh lý nền như viêm ruột mạn tính hay polyp đại trực tràng. Trong khi đó, một nghiên cứu khác lại ghi nhận nhóm người bệnh không mang đột biến KRAS có tỷ lệ tiền sử ung thư đường tiêu hóa cao hơn, gợi ý rằng sự xuất hiện đột biến KRAS có thể chịu ảnh hưởng nhiều từ yếu tố môi trường hoặc lối sống hơn là từ nền tảng di truyền. Đối với tiền sử gia đình, đột biến BRAF, đặc biệt biến thể V600E, rất hiếm gặp ở người bệnh UTĐTT có hội chứng Lynch - vốn liên quan đến đột biến các gen MMR. Chính vì vậy, sự hiện diện của BRAF V600E
显示前 20 页。下载资料查看完整内容。
暂无评论。快来抢沙发吧！
评论 (0)
暂无评论。快来抢沙发吧！