BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯƠNG NGỌC QUYÊN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI CÁC ESTE CỦA 2-MCPD, 3-MCPD VÀ GLYCIDOL LIÊN KẾT VỚI ACID BÉO TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT GC-MS/MS Ngành: HOÁ PHÂN TÍCH Mã ngành: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023
Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Công nghiệp TP. Hồ Chí Minh. Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Lê Đình Vũ Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 08 tháng 07 năm 2023. Thành phần Hộ i đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1. PGS.TS. Nguyễn Văn Cường ......................... - Chủ tịch Hội đồng 2. PGS.TS. Trần Quang Hiếu.............................. - Phản biện 1 3. TS. Nguyễn Quốc Hùng..................................- Phản biện 2 4. TS. Nguyễn Văn Trọng...................................- Ủy viên 5. TS. Đỗ Thị Long .............................................- Thư ký (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC PGS.TS. Nguyễn Văn Cường PGS.TS. Nguyễn Văn Cường
BỘ CÔNG THƯƠNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP Độc lập - Tự do - Hạnh phúc THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Trương Ngọc Quyên........................... MSHV: 20125561 Ngày, tháng, năm sinh: 28/08/1988 ............................... Nơi sinh: Đồng Nai Ngành: Hoá phân tích..................................................... Mã ngành: 8440118 I. TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu xác định đồng thời các este của 2-MCPD, 3-MCPD và glycidol liên kết với acid béo trong thực phẩm bằng kỹ thuật GC-MS/MS. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: (1) Xây dựng và thẩm định phương pháp thử với đầy đủ các thông số đáp ứng theo yêu cầu của TCVN ISO 17025:2017 để xác định hàm lượng các este của 2-MCPD, 3-MCPD, glycidol liên kết với acid béo trên nền mẫu thực phẩm bằng kỹ thuật GC- MS/MS đáp ứng quy định của EU về ngưỡng cho phép. (2) Ứng dụng quy trình phân tích để đánh giá thực trạng hàm lượng các este của 2-MCPD, 3-MCPD, glycidol liên kết với acid béo trên mộ t số sản phẩm mì gói, snack trên thị trường Thành phố Hồ Chí Minh. II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 17/10/2022 III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/4/2023 IV. NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Lê Đình Vũ Tp. Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 20 … NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO PGS.TS. Lê Đình Vũ TS. Nguyễn Quốc Thắng TRƯỞNG KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC PGS.TS. Nguyễn Văn Cường
CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM Thiết bị, dụng cụ Các dụng cụ cơ bản trong phòng thí nghiệm như ống ly tâm, vial thủy tinh, micropipette các loại, bình định mức, màng lọc 0.45 μm polytetrafluoroethylene… Cân phân tích QUINTIX224-1S chính xác đến 0.01 mg, 0.1 mg và 0.01 g (SARTORIUS, Đức) Máy lắc Benchmixer XL Multitube Vortexer BV1010-E (Benchmark, USA) Máy lắc vortex HWASHIN TECHNOLOGY 250VM (Hàn Quốc). Máy ly tâm có làm lạnh 5810R (Eppendorf, Đức) Thiết bị thổi khí Evarorator Xcel Vap 19-5671 (Horizon, Mỹ) Bể siêu âm điều nhiệt Ultrasonic 30L 18123001 (Ovan, Tây Ban Nha) Cộ t chiết pha rắn (SPE): cộ t LC-NH2 loại 6 mL của Sigma-Aldrich hoặc tương đương. Hệ thống GC-8890 ghép nối đầu dò khối phổ ba tứ cực 7000D của hãng Agilent (Mỹ) Hệ thống GC với bộ tiêm mẫu tự độ ng, cộ t mao quản mở DB-5MS kích thước 20 m × 0.18 mm, độ dày của lớp pha tĩnh 0.18 μm. Chất chuẩn, hóa chất 2.2.1 Chất chuẩn 2.2.1.1 Chuẩn và nội chuẩn tinh khiết Tấ t cả các chuẩn phân tích và chuẩn đồng vị đều là sản phẩm của Sigma Aldrich, được bảo quản ở -18 0C. Rac 1,2-Bis-palmitoyl-3-chloropropanediol (PP-3-MCPD), P ≥ 98 % 1,3-Dipalmitoyl-2-chloropropanediol (PP-2-MCPD), P ≥ 98 %. Glycidyl palmitate, P ≥ 98 %. Rac 1,2-Bis-palmitoyl-3-chloropropanediol-d5 (PP-3-MCPD-d5), P ≥ 98 %. 1,3-Dipalmitoyl-2-chloropropanediol-d5 (PP-2-MCPD-d5), P ≥ 98 %. 27
Glycidyl palmitate-d5 (Gly-P-d5), P ≥ 97 %. 2.2.1.2 Dung dịch chuẩn và nội chuẩn gốc – 1000 mg/L Cân chính xác khoảng 10 mg các chuẩn tinh khiết dạng ester vào các bình định mức 10 mL tương ứng, hòa tan và định mức tới vạch bằng toluene. Tính toán lại nồng độ các chấ t chuẩn, quy về dạng tự do (alcohol) tương ứng dựa vào công thức sau mPK (mg/L) (2-1) X 1000 V Trong đó: m là khối lượng cân chuẩn (mg); P là độ tinh khiết của chuẩn (%); V là thể tích định mức (mL); K là hệ số chuyển đổi từ dạng ester sang dạng alcohol tương ứng. Bảng 2.1 Hệ số chuyển đổi từ dạng ester sang dạng alcohol tương ứng PP-3- PP-2- PP-3- PP-2- Gly- Cấu tử Gly-P MCPD- MCPD- MCPD MCPD P-d5 d5 d5 Khối lượng phân tử 587.36 587.36 312.49 592.39 592.39 317.52 dạng ester Khối lượng phân tử 110.54 110.54 74.08 115.54 115.54 79.08 dạng alcohol Hệ số K 0.1882 0.1882 0.2371 0.1950 0.1950 0.2491 2.2.1.3 Chuẩn và nội chuẩn trung gian Dung dịch nộ i chuẩn trung gian: 1.0 mg/L trong toluene. Dung dịch chuẩn trung gian 1: 5.0 mg/L trong toluene. Dung dịch chuẩn trung gian 2: 0.1 mg/L trong toluene. 2.2.1.4 Chuẩn làm việc Cân khoảng 0,1 g dầu olive (mẫu blank) vào 05 ống nghiệm được đánh số từ C1 đến C5 và thực hiện thêm chuẩn theo Bảng 2.2. 28
Bảng 2.2 Bảng cách pha chuẩn Chuẩn C1 C2 C3 C4 C5 Nồng độ chạy, μg/L 5.00 30.0 100 300 1000 Khối lượng cân mẫu blank, g 0,1 V hút chuẩn hỗn hợp 0,1 mg/L, μL 50.0 300 - - - V hút chuẩn hỗn hợp 5 mg/L, μL - - 20.0 60.0 200 V hút nộ i chuẩn hỗn hợp 1 mg/L, μL 50.0 V hút THF, mL 2.00 2.2.2 Hóa chất Tetra hydrofuran – THF. Methanol. Toluene. Acid sulfuric. Sodium hydro cacbonat, NaHCO3 Sodium bromide, NaBr. Dung dịch NaHCO3 0.6 % w/v: Hòa tan 0.6 g NaHCO3 trong 100 mL nước. Dung dịch NaHCO3 bão hòa: Hòa tan 9.6 g NaHCO3 trong 100 mL nước. Dung dịch H2SO4/MeOH 1.8% v/v: Hút 1.8 mL H2SO4 vào bình định mức 100 mL và định mức tới vạch bằng metanol. Dung dịch sodium sulfate 20 %, w/v : Cân chính xác 20 g Na2SO4 khan vào bình định mức 100 mL, hòa tan và định mức tới vạch bằng nước cấ t. Dung dịch NaBr 10 %, w/v: Cân chính xác 1,0 g NaBr vào bình định mức 10 mL, hòa tan và định mức tới vạch bằng nước cấ t. Dung dịch NaBr 3000 mg/L, acid sulfuric 5 % v/v: Hút 180 μL dung dịch NaBr 10%, 0.3 mL sulfuric acid đậm đặc và 5.5 mL nước cấ t vào ống nhựa 15 mL, đậy nắp lắc đều. Hỗn hợp rửa giải n-hexane: ethyl acetate (85:15, v/v): Trộ n 85 mL n-hexane với 15 mL ethyl acetate, lắc đều và chứa trong bình có nắp vặn. 29
Nguyên tắc của phương pháp Đây là phương pháp phân tích gián tiếp, 2-MCPDE, 3-MCPDE, GE sẽ được chuyển hóa về dạng tự do tương ứng bằng cách thủy phân trong môi trường acid có methanol, riêng GE sẽ được bromide hóa chuyển thành 3-MPBD, sau đó tạo dẫn xuấ t với PBA. Phương pháp trải qua bốn bước chính : Chiết béo và làm sạch: Chấ t béo trong mẫu được chiết bằng dung môi ethyl acetate, lượng chấ t béo thu được sau đó được làm sạch bằng cách qua cộ t SPE để loại bỏ các mono và diglyceride. Bromide hóa: GE sau đó được chuyển thành 3-MBPDE trong môi trường acid có chứa NaBr. Thủy phân: Sau khi brom hóa, các MCPDE và 3-MBPDE được thủy phân trong môi trường acid thành methyl ester và các alcohol tương ứng (3-MCPD, 2-MCPD và 3-MBPD). Chiết chấ t phân tích dạng tự do (alcohol) và tạo dẫn xuấ t: Chiết các alcohol sinh ra bằng ethyl acetate và tạo dẫn xuấ t với PBA để phân tích bằng GC-MS/MS. Chuẩn bị mẫu sơ bộ Đối với nền mẫu thực phẩm là các sản phẩm đóng hộ p đã đồng nhấ t như sữa bộ t, sữa nước, nước tương chúng tôi trộ n đều mẫu trước khi cân. Đối với nền mẫu mì gói, chúng tôi tiến hành xay vắt trước, sau đó cho gói rau, gói dầu sa tế và gia vị vào đồng nhấ t, lấ y hết lượng dầu trong gói dầu sa tế, đồng nhấ t mẫu theo từng đơn vị mẫu. Đối với thịt sấ y, snack chúng tôi dùng cối đồng nhấ t mẫu. Đồng nhấ t mẫu theo từng đơn vị mẫu. Tấ t cả các mẫu sau khi đã đồng nhấ t được bảo quản ở nhiệt độ phòng. 30
Thông số, điều kiện thiết bị 2.5.1 Điều kiện thiết bị GC Sau khi tạo dẫn xuấ t các chấ t phân tích sẽ chuyển thành các hợp chấ t kém phân cực, theo tham khảo tài liệu chúng tôi sử dụng cộ t DB-5MS kích thước 20 m × 0.18 mm, độ dày của lớp pha tĩnh 0.18 μm. Tham khảo và chọn thể tích tiêm, chọn chế độ tiêm, khí mang sử dụng, cài đặt tốc độ dòng khí. Tối ưu chương trình nhiệt ở lò cộ t. Sau đó tiến hành chạy các chuẩn đơn với nồng độ 1.0 μg/ml đã được tạo dẫn xuấ t với PBA của 2-MCPD, 3-MCPD, 3-MBPD (sau khi đã bromide hóa) để xác định thời gian lưu của các chuẩn đơn và nộ i chuẩn. 2.5.2 Điều kiện đầu dò MS Với nguồn ion hóa EI thì năng lượng ion hóa khoảng 70 eV, chúng tôi chọn chế độ full scan để tìm các mảnh ion mẹ cho từng chấ t. Chúng tôi sẽ khảo sát năng lượng bắn phá thích hợp để lựa chọn ion định danh, định lượng. Sau khi chạy scan các dẫn xuấ t PBA với chuẩn đơn và nộ i chuẩn đơn của các chấ t ở nồng độ 1.0 μg/mL chúng tôi sẽ có phổ MS của các chấ t. Dựa trên thực tế và tham chiếu AOAC 2018.03, cường độ tín hiệu của các mảnh chúng tôi có được các mảnh ion mẹ, mảnh ion con, mảnh ion định danh, mảnh ion định lượng. Tiêu chí lựa chọn sẽ dựa vào quy định về tỉ lệ ion xác định so với ion định lượng [52] và số điểm identification point (IP) theo quy định của EC. Bảng 2.3 Qui định của EC về số điểm IP cho mộ t kỹ thuật phân tích [52] Kỹ thuật Số lượng mảnh ion Số điểm IP GC-MS (EI hoặc CI) N N GC-MS (EI và CI) 2 (EI) + 2 (CI) 4 GC-MS (EI hoặc CI) tạo 2 (Chất dẫn xuất A) + 2 4 dẫn xuất (Chất dẫn xuất B) LC-MS N N GC-MS/MS 1 mảnh mẹ và 2 mảnh con 4 31
Kỹ thuật Số lượng mảnh ion Số điểm IP GC-MS/MS 2 mảnh mẹ và 2 mảnh con 5 LC-MS/MS 1 mảnh mẹ và 2 mảnh con 4 1 mảnh mẹ, 1 mảnh con và LC-MS/MS/MS 5.5 2 mảnh con của ion con HR-MS N 2n GC-MS và LC-MS 2+2 4 GC-MS và HR-MS 2+2 4 Tối ưu quy trình xử lý mẫu 2.6.1 Tối ưu khối lượng mẫu cân trên các nền thực phẩm Vì các MCPDE, GE thường xuấ t hiện trong các mẫu chứa chấ t béo có xử lý nhiệt nên lượng mẫu cân cần thiết có ảnh hưởng đến hiệu suấ t chiết chấ t béo trên nền mẫu cũng như hiệu suấ t chiết chấ t phân tích, đồng thời ảnh hưởng đến việc đảm bảo lượng béo đủ lớn để đạt giới hạn phát hiện. Theo AOAC 2018.03 về phân tích MCPDE, GE trong nền sữa thì lượng mẫu tương ứng với phần trăm chấ t béo có trong nền mẫu, chẳng hạn sữa bộ t có béo từ 20-30% thì lượng mẫu cân là 0.5g, sữa dạng lỏng có béo từ 3-5% thì lượng mẫu cân là 3.0 g, sữa có hàm lượng béo từ 6 -12% thì lượng mẫu cân 1.5 g. Như vậy, với các nền mẫu chúng tôi chuẩn bị thẩm định như mì gói (hàm lượng béo 10-20%), nước tương (hàm lượng béo 0%, lượng vết), thịt sấ y (hàm lượng béo 10- 16%), sữa bộ t (hàm lượng béo 20 -30%) chúng tôi sẽ khảo sát lượng mẫu cân từ 0.5g, 1.0g, 2.0g đối với nền mì gói, nền sữa bộ t, đây là 2 nền có hàm lượng béo cao trong các nền sẽ thẩm định. Với ba lượng mẫu cân trên, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với quy trình tham khảo, ghi nhận hàm lượng các MCPDE, GE và đánh giá kết quả. 2.6.2 Khảo sát nồng độ NaBr, nồng độ H2SO4, thời gian phản ứng ảnh hưởng đến quá trình bromide hóa GE Vòng epoxide của GE có thể mở ra khi mộ t trong các nguyên tử carbon của epoxide bị tấ n công bởi tác nhân nucleophile trong điều kiện kiềm trung tính hoặc acid [53]. Trong đó, với môi trường acid thì tốc độ của các nucleophile tăng lên đáng kể do phản ứng thuận nghịch và khả năng phản ứng mạnh của acid liên hợp với epoxide 32
[54]. Tuy nhiên, môi trường acid cũng có khả năng làm tăng sự hình thành ex-novo của các hợp chấ t halogen hóa, chẳng hạn như 3-MCPD, bằng phản ứng của mộ t phần acylglycerol (thành phần của dầu và chấ t béo) với các ion halogen. Như vậy nồng độ H2SO4 là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suấ t phản ứng chuyển hóa GE thành 3-MBPD. Ở đây chúng tôi sẽ khảo sát với 4 nồng độ 1%, 3%, 5%, 7%, bằng cách thêm chuẩn 1.0 μg/mL trên nền dầu olive . Bên cạnh đó, nồng độ bromide cũng là điều kiện quan trọng cho phản ứng, ảnh hưởng trực tiếp đến tín hiệu của 3-MBPD trên thiết bị. Mặc dù phản ứng của bromide với GE diễn ra nhanh do phản ứng mạnh mẽ của vòng epoxide nhưng nếu nồng độ bromide quá thấ p sẽ dẫn đến phản ứng không hoàn toàn. Ngược lại, nếu nồng độ bromide quá cao thì các acylglycerol không được loại bỏ hoàn toàn trong quá trình xử lý mẫu sẽ phản ứng với bromide dẫn đến hàm lượng GE bị sai số dương. Như vậy, nồng độ bromide ảnh hưởng trực tiếp đến độ chính xác của hàm lượng GE. Do đó, chúng tôi sẽ khảo sát nồng độ bromide ở giai đoạn này bằng cách thay đổi nồng độ bromide so với tài liệu tham khảo ở 4 mức 1000, 3000, 4000, 7000 mg/L. Khảo sát được thực hiện với chuẩn hỗn hợp 1.0 μg/mL trên nền dầu olive. Thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng cũng được chúng tôi xem xét khi khảo sát để đưa ra quy trình tối ưu cho việc thẩm định. Theo nhiều tài liệu nhiệt độ được áp dụng là 50 0C, thời gian phản ứng 15 phút. Ở đây chúng tôi thay đổi thời gian phản ứng để khảo sát 3-MBPD hình thành và bền trong thời gian bao lâu, điều này ảnh hưởng phần nào đến tín hiệu 3-MBPD trên thiết bị. Thời gian được khảo sát ở 1 phút, 10 phút, 15 phút, 30 phút trên chuẩn 1.0 μg/mL. 2.6.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng muối ăn đến phương pháp Có nhiều nghiên cứu về sự chuyển hóa thuận nghịch giữa glycidol và 3-MCPD khi có ion Cl- trong môi trường acid [14, 51], bên cạnh đó ở phản ứng bromide hóa GE, nếu có mặt ion Cl- trong môi trường acid thì có thể xảy ra sự canh tranh phản ứng giữa bromide và chloride với GE dẫn đến tín hiệu của GE sẽ bị giảm, ảnh hưởng đến kết quả phân tích GE và 3-MCPDE. Trong khi đó đặc trưng trong nền mẫu thực phẩm 33
앞 10페이지만 표시됩니다. 전체를 보려면 자료를 다운로드하세요.
댓글이 없습니다. 첫 댓글을 남겨보세요!
댓글 (0)
댓글이 없습니다. 첫 댓글을 남겨보세요!